紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是一種廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物化學(xué)、制藥和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的分析儀器，能夠快速、簡(jiǎn)便地評(píng)估樣品純度。本文將詳細(xì)介紹利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行樣品純度檢測(cè)的原理、方法和注意事項(xiàng)。
一、檢測(cè)原理
紫外可見(jiàn)分光光度法基于樣品分子對(duì)特定波長(zhǎng)紫外或可見(jiàn)光的吸收特性。當(dāng)光通過(guò)樣品溶液時(shí)，樣品中的分子會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的光，導(dǎo)致透射光強(qiáng)度減弱。根據(jù)朗伯-比爾定律，吸光度(A)與樣品濃度(c)成正比：
A=εcl
其中ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光程長(zhǎng)度(通常為1cm)。純度檢測(cè)主要利用這一原理，通過(guò)比較樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，或通過(guò)分析吸收光譜特征來(lái)判斷樣品純度。
二、操作步驟
1.樣品準(zhǔn)備：將待測(cè)樣品溶解于適當(dāng)溶劑中，濃度通常控制在使吸光度在0.1-1.0范圍內(nèi)(此范圍內(nèi)儀器響應(yīng)最線性)。常用溶劑包括水、甲醇、乙腈等，需確保溶劑在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收。
2.儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)：打開(kāi)光度計(jì)電源，預(yù)熱15-30分鐘。用純?nèi)軇┳鳛榭瞻走M(jìn)行基線校正，確保儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)。
3.光譜掃描：設(shè)置合適的波長(zhǎng)范圍(通常200-800nm)，對(duì)樣品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，獲取吸收光譜。
4.數(shù)據(jù)分析：
-觀察吸收峰位置和形狀是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致
-計(jì)算特定波長(zhǎng)下的吸光度比值，判斷是否存在雜質(zhì)
-通過(guò)摩爾吸光系數(shù)計(jì)算樣品濃度，評(píng)估純度
5.定量分析：在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或已知的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算樣品濃度和純度。
三、純度評(píng)估方法
1.吸收峰比值法：純化合物在紫外可見(jiàn)區(qū)的吸收峰位置和相對(duì)強(qiáng)度是特定的。通過(guò)比較樣品在不同波長(zhǎng)下的吸光度比值與標(biāo)準(zhǔn)品的差異，可判斷純度。例如，核酸純度常通過(guò)A260/A280比值評(píng)估。
2.光譜形狀分析：純物質(zhì)的光譜曲線平滑，特征峰明顯。雜質(zhì)的存在常導(dǎo)致基線抬高、峰形不對(duì)稱或出現(xiàn)額外小峰。
3.摩爾吸光系數(shù)法：對(duì)于已知ε值的化合物，通過(guò)測(cè)定吸光度可計(jì)算濃度，進(jìn)而評(píng)估純度。需準(zhǔn)確知道樣品分子量和光程長(zhǎng)度。
4.導(dǎo)數(shù)光譜法：利用高階導(dǎo)數(shù)光譜增強(qiáng)細(xì)微光譜差異的識(shí)別，提高對(duì)微量雜質(zhì)的檢測(cè)靈敏度。
四、注意事項(xiàng)
1.溶劑選擇：確保溶劑在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)顯著吸收，且能充分溶解樣品。常用溶劑截止波長(zhǎng)：水(190nm)、乙腈(190nm)、甲醇(205nm)、氯仿(245nm)。
2.濃度控制：吸光度最好在0.1-1.0范圍內(nèi)，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致偏離比爾定律，過(guò)低則信噪比差。可通過(guò)稀釋或濃縮調(diào)整。
3.比色皿清潔：使用前后用適當(dāng)溶劑清洗比色皿，避免刮傷光學(xué)面。指紋或污漬會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)量結(jié)果。
4.溫度控制：某些化合物的吸收特性受溫度影響明顯，必要時(shí)使用恒溫比色皿架。
5.儀器性能驗(yàn)證：定期用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如重鉻酸鉀溶液)驗(yàn)證儀器波長(zhǎng)準(zhǔn)確性和吸光度準(zhǔn)確性。
五、應(yīng)用實(shí)例
1.蛋白質(zhì)純度檢測(cè)：通過(guò)A280/A260比值評(píng)估蛋白質(zhì)樣品中核酸污染程度，純蛋白比值約1.8。
2.DNA/RNA純度檢測(cè)：純DNA的A260/A280比值約1.8，RNA約2.0，偏離此值表明可能有蛋白質(zhì)或酚類(lèi)污染。
3.藥物純度檢測(cè)：比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜的一致性，檢測(cè)可能存在的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物。
紫外可見(jiàn)分光光度法作為快速、簡(jiǎn)便的純度檢測(cè)手段，雖不能替代色譜等分離分析方法，但在日常質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)過(guò)程監(jiān)測(cè)中具有重要價(jià)值。結(jié)合其他分析技術(shù)，可對(duì)樣品純度做出更全面評(píng)估。
